在兒科與遺傳代謝的門診中，我常常遇到非常焦急的家長。他們帶著囡仔兄、囡仔姊跑遍了各大醫院，甚至抽血做了最先進的基因檢測，最後卻得到一句：「目前還找不到明確的基因變異。」
這時候，家長往往會感到非常無助。其實，找不到原因，很多時候是因為「檢查工具的極限」。今天 I-sir 要來跟各位介紹一個在遺傳醫學界帶來大改進的最新技術——在兒科與遺傳代謝的門診中，我常常遇到非常焦急的家長。他們帶著囡仔兄、囡仔姊跑遍了各大醫院，甚至抽血做了最先進的基因檢測，最後卻得到一句：「目前還找不到明確的基因變異。」
這時候，家長往往會感到非常無助。其實，找不到原因，很多時候是因為「檢查工具的極限」。今天 I-sir 要來跟各位介紹一個在遺傳醫學界帶來大改進的最新技術——長片段定序技術 (Long-read sequencing)。
什麼是基因定序？讓我們從「拼圖」講起。
什麼是基因定序？讓我們從「拼圖」講起
人類的基因組就像是一本超級厚重的生命百科全書，裡面寫滿了約 30 億個字母（鹼基對，base pair）。我們想要知道小朋友是不是哪裡生病了，就需要去「讀」這本書，看看是不是哪個段落寫錯了。
傳統定序（短讀取）的極限在哪裡？
目前臨床上最常使用的是「次世代定序 (NGS)」，也就是所謂的短讀取定序。這種技術非常快速且普及，但它有一個致命傷：它必須先把生命百科全書放進碎紙機，切成無數個極短的片段。
每次只能看 150 個字母的挑戰
傳統短讀取的長度，大約只有 150 到 300 個字母。你可以想像，如果百科全書裡有一整頁都在重複寫著同樣的句子，當這頁被切成碎片後，電腦根本無法分辨哪一片該拼在哪裡，甚至會漏掉一大段。這就是為什麼，有些大型的基因結構變異，在傳統檢測中會像隱形一樣，完全找不到 。
迎接大改進！什麼是「長片段定序」(Long-read sequencing)？
為了解決這個「拼圖卡關」的問題，科學家開發出了」技術。這個技術不需要把書本切得那麼碎，它可以直接閱讀好幾大頁的內容！
一次看懂幾萬個字母的超能力
顧名思義，長讀取定序可以一次讀取非常長的 DNA 片段。如果說短讀取是「單字」，那長讀取就是「完整的段落」甚至是「整個章節」。長讀取定序能夠同時解決重複區域的定序問題，並且精準偵測出結構變異 (Structural variants, SVs) 與串聯重複序列擴增 (Tandem repeat expansions) 。
實際能讀多長？(10,000 到百萬 bp)
長讀取定序的讀取長度，通常從 10,000 個字母 (10 kb) 起跳，甚至可以達到 1,000,000 個字母 (1 Mb) 以上！
💡 I-sir 台語小教室：一橛 (tsi̍t-kue̍h)
在台語裡面，形容一截、一段，我們叫做「一橛 (tsi̍t-kue̍h)」。
基因就像一塊一塊的積木或是磚塊，傳統定序只能「一橛紲一橛 (tsi̍t kue̍h suà tsi̍t kue̍h)」慢慢看；現在有了長讀取定序，我們可以「規站 (kui tsām )」一次看清楚，不會再因為片段太碎而迷失方向啦！
為什麼遺傳代謝疾病的囡仔會需要它？
遺傳代謝疾病 (Inherited metabolic diseases, IMD) 是一大群複雜的罕見疾病，雖然可以透過新生兒篩檢或是生化指標發現異常，但最終仍需要基因檢測來確診 。
抓出隱藏的基因大變異 (Structural Variants)
根據最新的醫學文獻指出，在許多傳統短讀取基因定序找不到原因的遺傳代謝疾病個案中，透過針對特定基因進行「長讀取定序」，成功找出了遺漏的致病變異 。
轉位子 (Transposable Elements) 的大發現
研究中特別提到，長片段定序甚至能抓出會自己移動的「轉座子片段插入」。轉座子佔了人類基因組很大一部分，它們的插入可能會打斷基因的正常表現，或是改變染色體的結構，進而導致疾病發生 。這些異常在過去的傳統技術下，幾乎是不可能被精準定位的。
I-sir 醫師的溫馨提醒
隨著科技的進步，長片段定序結合其他功能性檢測，已經成為我們擴展罕見疾病基因拼圖的重要武器 。雖然目前這項技術還在持續發展與普及中，但它無疑為許多還在迷宮中尋找答案的家庭，點亮了一盞明燈。
如果您對小朋友的成長發育或是遺傳基因檢測有任何疑問，歡迎來到新竹的門診，讓 I-sir 陪您一起找答案、想辦法！
英文摘要
Although next-generation sequencing has emerged as a powerful tool for diagnosing rare diseases (RD), many cases of inherited metabolic diseases (IMD) remain unsolved, hindering the diagnosis, clinical and therapeutic management of the patients.
The primary aim of this study is to address the most elusive cases by applying long-read sequencing (LRS) targeted to the gene of interest on seven patients (FARS2, GYS2, PEX1, SLC2A1, AGL, ACAT1, and ACADM), identifying six novel pathogenic variants including two intronic variants, a structural variant and three transposable elements (TE) insertions.
In addition, we have demonstrated the effect on splicing of an exonic variant previously reported as missense. Functional genetic tests specific for the expected effect of each variant of uncertain significance were designed, such as minigenes analysis or chromatin conformation capture assay.
From the TE insertions, two were located in the genomic region of GYS2 or PEX1, causing a reduction in their mRNA expression. The third was located 7.6 kb downstream of SLC2A1; it alters the interaction between the SLC2A1 promoter and its distal regulatory element via the establishment of a loop with the 3’ border of the native topologically associating domain.
This study shows that the combination of LRS and functional genetic assays confers a powerful approach for expanding the mutational spectrum of IMD, adding data to improve the diagnosis of this large group of RD.
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